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梯度PCR仪运用说明，梯度PCR仪需要注意的事项

发布时间：2014-03-27

　　Biometra Tg 梯度PCR仪运用说明
　　修改一个程序
　　按[C programs]进入修改形式。
　　要在主目录中创立一个程序请按[D enter]。
　　要进入一个子目录，用→键将光标向右移动，然后用↑↓键挑选一个子目录。挑选的目录会以强光杰出出来。按[D enter]进入挑选的子目录。
　　按[A list]阅读该目录下一切已树立文档和空文档的列表。
　　用↑↓键在列表中翻滚，然后用[D enter]承认其间一个回忆库
　　您如今能够输入热盖的温度了。
　　一般来说，盖子的温度大概比程序中的最高温高10 ℃。
　　完结了一切的预先设置之后，按[Denter]翻开设置页。
　　在这个设置页中，您能够输入您的循环中需求的一切参数。
　　梯度PCR仪设置页：
　　Temp[ ℃]      time  ←  #    gradient     options →
　　A  ?    B  insert/delete  C  pgm ok     D  enter
　　每一个设置都用[D enter]来承认。光标将主动移动到下一个区域。您也能够经过向前移动光标键来承认一个数值。
　　如今输入协议中榜首档的温度：
　　用[D enter]承认温度。
　　为其输入时刻，用小数点来距离。次序为h.m.s。
　　用[D enter]承认时刻设置，或许用光标键移动到下一个区域。
　　在Gradient下输入梯度的规模，最大梯度为40℃
　　循环是经过挑选回来循环的方针和回来循环的次数来界说的。在用←符号的列中，您能够挑选回来循环的方针档。
　　＃表明循环的次数。
　　设定循环值=总循环值-1，即，总循环数为30时应输入“29”。
　　用[C pgm ok]来贮存一个完好的程序。程序数据持久的贮存在回忆中：
　　梯度PCR仪运转程序
　　按[B start/stop]挑选一个程序。
　　用→↑↓键挑选一个子目录，或许用[D enter]进入主目录。
　　输入您想要发动的程序的号码。或许，按[A list]在该子目录中的所
　　有程序的列表中挑选一个程序。用↑↓键在列表中翻滚挑选。
　　用[D enter]承认用强光杰出的程序。
　　按[D start]发动程序。
　　调查运转状况
　　程序开端后可经过按A(Inf)来调查程序的运转过程和剩余时刻。梯度
　　功用开端运转时可经过按A(Inf) →A（gradient）来调查各孔的实践温度。
　　注意事项
　　1.盖上热盖后，顺时针旋转,听到咔嗒声即可。实验完毕开盖时请先逆时针旋转两圈，开释压力后再扳开关。
　　2.在BLOCK的四个角放入四个PCR管以保证热盖压力均衡。
　　3.必须保证梯度PCR仪底部(网格有些)的清洗，没有被尘埃或
　　其他物质阻塞。
　　4.运用完毕，待仪器降到室温后再将电源关闭（电扇主动关闭）
　　选用疾速循环荧光定量梯度PCR仪和LightScanner32上的非符号探针进行MAAB
　　简介
　　高分辩率熔解曲线能够经过扫描PCR的扩增片断来检测杂合体中基因序列的改变。合作运用高分辩的饱满荧光染料，在检测小于400bp的PCR片断的SNP、刺进或缺失时的灵敏度可达98%以上。该办法自开发以来，被不断的运用于新的范畴，如选用小片段扩增法和非符号探针法（LunaProbes）对已知序列进行基因分型。非符号探针的3’ 端被关闭，以防止PCR过程中的扩增，选用双链DNA的饱满染料LCGreen Plus和非符号探针（LunaProbes）熔解温度的不一样（Tm值）来区别不一样的基因型。非符号探针可用于基因分型中等位基因的定量，能够检测出骤变率≦10%的等位基因的骤变。
　　近来，一种根据疾速循环荧光定量梯度PCR仪和LightScanner32上的非符号探针的高分辩率熔解曲线剖析，进行骤变体等位基因的偏向性扩增（MAAB）的办法被开发的了出来，该办法能够添加非符号探针在检测等位基因骤变中的灵敏度。
　　Mutant Allele Amplification Bias（MAAB）原理
　　非符号探针的3’ 端被关闭，以防止PCR过程中的扩增。探针的规划和野生型等位基因彻底互补，和骤变的等位基因位点不彻底互补。骤变的等位基因的偏向性扩增主要是经过设定PCR反响的退火温度来完结的。PCR的退火温度要低于野生型等位基因探针的退火温度而高于骤变体等位基因的退火温度，介于彻底互补的探针（野生型位点）Tm值和非彻底互补的探针（骤变体的位点）Tm值之间。在该退火温度下，彻底互补的探针和方针DNA链依然联系在一起（Figure1a），因此按捺野生型序列的PCR反响（Figure1b），然后完结骤变体等位基因的偏向性扩增。
　　办法
　　用非符号探针在野生型等位基因的布景下检测骤变率≦1%的等位基因的骤变，运用了不一样的退火温度和不一样的核酸外切酶。选用3个不一样的基因用于检测：TP53（exon 8）与癌症有关的骤变，PAH（exon 11）与PKU（苯丙酮尿症）有关的骤变，还有一个与疟疾有关基因的对药物疗法具有抗性的骤变，然后运用一般的热发动梯度PCR仪做温度梯度PCR，来断定非符号探针的Tm值和一般的热发动梯度PCR仪是不是能够完结MAAB。
　　成果
　　核酸外切酶postive（NEB和Roche FastStart）没有呈现MAAB（65-75℃）（图2）。
　　运用非符号探针在没有MAAB时对每一个意图基因检测骤变的等位基因的灵敏度在5-10%(图3)。
　　运用热发动梯度PCR仪做温度梯度时，TP53 x8和PAH x11有MAAB（图4左）。可是疟疾有关基因在热发动的定量梯度PCR仪器上没有表现出骤变的等位基因的加强（图4右）。
　　之后选用疾速循环荧光定量梯度PCR仪和LightScanner32上的非符号探针的高分辩率熔解曲线，选用温度梯度进行骤变体等位基因的偏向性扩增。与运用一般的热发动梯度PCR仪比较，运用疾速定量梯度PCR仪，退火温度56℃时对MAAB有显着的影响。将纯合的WT和骤变的等位基因混合（50/50），证明了对骤变的等位基因的检出率能够在1%以下（图5）。
　　图 5. LunaProbes的标准化区别峰. 野生型的等位基因位点（灰色）= 62ºC，骤变型的等位基因位点（赤色）= 54ºC。58ºC作为退火温度来进行50–50的混合样品（黄色）的骤变等位基因的区别性扩增。这种扩增办法使得区别扩增的分辩率到达10倍，而且使得检测的灵敏性到0.7–1.5%
　　这一成果证明了运用非符号探针的MAAB比没有MAAB的检测的灵敏度要高。
　　梯度PCR仪定论
　　以下是运用非符号探针进行MAAB的重要参数：
　　1.温度转换率和PCR意图片度的温度
　　2.退火温度和探针的Tm值
　　3.核酸外切酶
　　注意这几个重要的参数后，本研讨中对骤变的等位基因的检测率能够到达1%，运用这种办法检测已知的体细胞骤变（p53，EGFR, BRAF），提前发现寄生虫感染防止药物医治不妥，高灵敏度检测胎儿DNA骤变。在LS32上进行定量PCR及高分辩溶解曲线剖析，联系运用运用疾速定量PCR办法和非符号探针关于MAAB至关重要。




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  • 梯度PCR仪运用说明，梯度PCR仪需要注意的事项
  • 发布时间：2014-03-27 00:00
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    　　要在主目录中创立一个程序请按[D enter]。
    　　要进入一个子目录，用→键将光标向右移动，然后用↑↓键挑选一个子目录。挑选的目录会以强光杰出出来。按[D enter]进入挑选的子目录。
    　　按[A list]阅读该目录下一切已树立文档和空文档的列表。
    　　用↑↓键在列表中翻滚，然后用[D enter]承认其间一个回忆库
    　　您如今能够输入热盖的温度了。
    　　一般来说，盖子的温度大概比程序中的最高温高10 ℃。
    　　完结了一切的预先设置之后，按[Denter]翻开设置页。
    　　在这个设置页中，您能够输入您的循环中需求的一切参数。
    　　梯度PCR仪设置页：
    　　Temp[ ℃]      time  ←  #    gradient     options →
    　　A  ?    B  insert/delete  C  pgm ok     D  enter
    　　每一个设置都用[D enter]来承认。光标将主动移动到下一个区域。您也能够经过向前移动光标键来承认一个数值。
    　　如今输入协议中榜首档的温度：
    　　用[D enter]承认温度。
    　　为其输入时刻，用小数点来距离。次序为h.m.s。
    　　用[D enter]承认时刻设置，或许用光标键移动到下一个区域。
    　　在Gradient下输入梯度的规模，最大梯度为40℃
    　　循环是经过挑选回来循环的方针和回来循环的次数来界说的。在用←符号的列中，您能够挑选回来循环的方针档。
    　　＃表明循环的次数。
    　　设定循环值=总循环值-1，即，总循环数为30时应输入“29”。
    　　用[C pgm ok]来贮存一个完好的程序。程序数据持久的贮存在回忆中：
    　　梯度PCR仪运转程序
    　　按[B start/stop]挑选一个程序。
    　　用→↑↓键挑选一个子目录，或许用[D enter]进入主目录。
    　　输入您想要发动的程序的号码。或许，按[A list]在该子目录中的所
    　　有程序的列表中挑选一个程序。用↑↓键在列表中翻滚挑选。
    　　用[D enter]承认用强光杰出的程序。
    　　按[D start]发动程序。
    　　调查运转状况
    　　程序开端后可经过按A(Inf)来调查程序的运转过程和剩余时刻。梯度
    　　功用开端运转时可经过按A(Inf) →A（gradient）来调查各孔的实践温度。
    　　注意事项
    　　1.盖上热盖后，顺时针旋转,听到咔嗒声即可。实验完毕开盖时请先逆时针旋转两圈，开释压力后再扳开关。
    　　2.在BLOCK的四个角放入四个PCR管以保证热盖压力均衡。
    　　3.必须保证梯度PCR仪底部(网格有些)的清洗，没有被尘埃或
    　　其他物质阻塞。
    　　4.运用完毕，待仪器降到室温后再将电源关闭（电扇主动关闭）
    　　选用疾速循环荧光定量梯度PCR仪和LightScanner32上的非符号探针进行MAAB
    　　简介
    　　高分辩率熔解曲线能够经过扫描PCR的扩增片断来检测杂合体中基因序列的改变。合作运用高分辩的饱满荧光染料，在检测小于400bp的PCR片断的SNP、刺进或缺失时的灵敏度可达98%以上。该办法自开发以来，被不断的运用于新的范畴，如选用小片段扩增法和非符号探针法（LunaProbes）对已知序列进行基因分型。非符号探针的3’ 端被关闭，以防止PCR过程中的扩增，选用双链DNA的饱满染料LCGreen Plus和非符号探针（LunaProbes）熔解温度的不一样（Tm值）来区别不一样的基因型。非符号探针可用于基因分型中等位基因的定量，能够检测出骤变率≦10%的等位基因的骤变。
    　　近来，一种根据疾速循环荧光定量梯度PCR仪和LightScanner32上的非符号探针的高分辩率熔解曲线剖析，进行骤变体等位基因的偏向性扩增（MAAB）的办法被开发的了出来，该办法能够添加非符号探针在检测等位基因骤变中的灵敏度。
    　　Mutant Allele Amplification Bias（MAAB）原理
    　　非符号探针的3’ 端被关闭，以防止PCR过程中的扩增。探针的规划和野生型等位基因彻底互补，和骤变的等位基因位点不彻底互补。骤变的等位基因的偏向性扩增主要是经过设定PCR反响的退火温度来完结的。PCR的退火温度要低于野生型等位基因探针的退火温度而高于骤变体等位基因的退火温度，介于彻底互补的探针（野生型位点）Tm值和非彻底互补的探针（骤变体的位点）Tm值之间。在该退火温度下，彻底互补的探针和方针DNA链依然联系在一起（Figure1a），因此按捺野生型序列的PCR反响（Figure1b），然后完结骤变体等位基因的偏向性扩增。
    　　办法
    　　用非符号探针在野生型等位基因的布景下检测骤变率≦1%的等位基因的骤变，运用了不一样的退火温度和不一样的核酸外切酶。选用3个不一样的基因用于检测：TP53（exon 8）与癌症有关的骤变，PAH（exon 11）与PKU（苯丙酮尿症）有关的骤变，还有一个与疟疾有关基因的对药物疗法具有抗性的骤变，然后运用一般的热发动梯度PCR仪做温度梯度PCR，来断定非符号探针的Tm值和一般的热发动梯度PCR仪是不是能够完结MAAB。
    　　成果
    　　核酸外切酶postive（NEB和Roche FastStart）没有呈现MAAB（65-75℃）（图2）。
    　　运用非符号探针在没有MAAB时对每一个意图基因检测骤变的等位基因的灵敏度在5-10%(图3)。
    　　运用热发动梯度PCR仪做温度梯度时，TP53 x8和PAH x11有MAAB（图4左）。可是疟疾有关基因在热发动的定量梯度PCR仪器上没有表现出骤变的等位基因的加强（图4右）。
    　　之后选用疾速循环荧光定量梯度PCR仪和LightScanner32上的非符号探针的高分辩率熔解曲线，选用温度梯度进行骤变体等位基因的偏向性扩增。与运用一般的热发动梯度PCR仪比较，运用疾速定量梯度PCR仪，退火温度56℃时对MAAB有显着的影响。将纯合的WT和骤变的等位基因混合（50/50），证明了对骤变的等位基因的检出率能够在1%以下（图5）。
    　　图 5. LunaProbes的标准化区别峰. 野生型的等位基因位点（灰色）= 62ºC，骤变型的等位基因位点（赤色）= 54ºC。58ºC作为退火温度来进行50–50的混合样品（黄色）的骤变等位基因的区别性扩增。这种扩增办法使得区别扩增的分辩率到达10倍，而且使得检测的灵敏性到0.7–1.5%
    　　这一成果证明了运用非符号探针的MAAB比没有MAAB的检测的灵敏度要高。
    　　梯度PCR仪定论
    　　以下是运用非符号探针进行MAAB的重要参数：
    　　1.温度转换率和PCR意图片度的温度
    　　2.退火温度和探针的Tm值
    　　3.核酸外切酶
    　　注意这几个重要的参数后，本研讨中对骤变的等位基因的检测率能够到达1%，运用这种办法检测已知的体细胞骤变（p53，EGFR, BRAF），提前发现寄生虫感染防止药物医治不妥，高灵敏度检测胎儿DNA骤变。在LS32上进行定量PCR及高分辩溶解曲线剖析，联系运用运用疾速定量PCR办法和非符号探针关于MAAB至关重要。
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