高压蒸汽灭菌锅的使用方法

1、器材

牛肉膏蛋白胨培养基，培养皿（6套一包），手提式高压蒸汽菌锅等。2、操作步骤

1．首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。

2．放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。

3．加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

4．用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用1．05kg/cm2，121．3℃，20分钟灭菌。

5．灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。

6．将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。

稀释倒平板法

先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000…），然后分别取不同稀释液少许，与已溶化并冷却至45℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出出菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。倒平板的两种方法持皿法

⑴将若干无菌培养皿叠放在左侧，便于拿取。

⑵点燃煤气灯，将火焰调到适中（空气不要太大，以免气流过急）。

⑶倒平板时，先用左手握住三角瓶的底部，倾斜三角瓶，用右手旋松棉塞，然后用右手的小指和手掌边缘夹住棉塞并将它拔出（切勿将棉塞放在桌面上），随之将瓶口周缘在火焰上过一下（不可灼烧，以防爆裂，以杀死可指沾在瓶口外的杂菌。然后将三角瓶从左手传至右手中（用右手的拇指、食指和中指拿住三角瓶的底部），在这操作过程中瓶口应保持在离火焰2~3处，瓶口始终向着火焰。左手拿起一套培养皿，用中指、无名指和小指托住培养皿底部，用食指和大拇指夹住皿盖并开启一缝，恰好能让三角瓶伸入，随后倒出培养基。一般约倒入12ml的培养基即可铺满整个皿底。盖上皿盖，置水平位置等凝。然后再将三角瓶移至左手，瓶口再次过火并塞紧棉塞。

平板培养基的冷凝方法有两种，一种是将平板一个个摊开在桌面上冷凝，另一方法是将几个平板叠在一起冷凝。前者冷凝速度较快，在室温较高时采用；而后者冷凝速度较慢，可在室温较低时采用，其优点是形成冷凝水少，尤其适用于平板划线等的需要。

叠皿法

此法步骤与持皿法基本相同。不同点是左手不必持培养皿，而是将培养皿叠放在煤气灯的左侧并靠近火焰，用右手拿住三角瓶的底部，左手的掌背对着瓶口，用小指与无名指夹住瓶塞，将其拔出，随即使瓶口过火，同时用左手开启最上面的皿盖，倒入培养基，盖上皿盖即移至水平位置待凝。再依次倒下面的平板。在操作过程中，瓶口应向着火焰保持倾斜状，以防空气中微生物的污染。